Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas (Registro nro. 101982)

Abstract

Las células madre mesenquimales (CMM) han sido ampliamente estudiadas en los últimos 30 años por su gran potencial clínico. Numerosas evidencias muestran que los efectos restauradores y regenerativos de las CMM se deben principalmente a sus efectos paracrinos mediados por su secretoma. Estas células liberan factores de crecimiento y citoquinas que modulan procesos celulares como la proliferación, la diferenciación, la inmunomodulación, la migración, la angiogénesis y la supervivencia. El secretoma de las CMM está compuesto tanto por factores solubles, como por factores liberados dentro de vesículas extracelulares (VE). Los exosomas, que se encuentran entre las VE secretadas por las CMM, son pequeñas vesículas de entre 50 y 120 nm de diámetro que están demostrando ser una valiosa fuente de información específica así también como huellas digitales de la progresión de enfermedades y como potenciales biomarcadores en diferentes estados fisiopatológicos.<br/>Por otra parte, la regeneración de heridas es un proceso complejo que requiere la migración celular, el desarrollo de un entorno inflamatorio, la angiogénesis, la granulación, la formación de tejido, la re-epitelización y la remodelación de la matriz extracelular (ME). Las CMM y su secretoma tienen un papel activo en este proceso, y se ha demostrado que la aplicación terapéutica de estas células mejora los resultados de la cicatrización de heridas. Por este motivo, en los últimos años se han estudiado diferentes maneras de modificar y aumentar las capacidades regenerativas de las CMM con el objetivo de desarrollar posibles terapias para la curación de heridas cutáneas. SPARC, también conocida como osteonectina, parece ser un actor clave del proceso regenerativo.<br/>SPARC es una glicoproteína multifuncional que se une al Ca2+ y pertenece a la familia de las proteínas de la ME. En animales adultos, su expresión se limita en gran medida a los tejidos en reparación o remodelación ya sea por heridas, enfermedades o procesos naturales, como los huesos y la mucosa intestinal. Se ha demostrado que SPARC regula el mecanismo de acción de varios factores de crecimiento y angiogénicos, así como también interactúa con diversas integrinas y proteasas regulando su expresión y actividad. Todas estas proteínas intervienen en numerosos mecanismos asociados al proceso de cicatrización tales como la migración, proliferación, diferenciación, angiogénesis y supervivencia celular, por lo que SPARC podría tener un rol clave en la regulación de este proceso regenerativo.<br/>Como se mencionó anteriormente, las CMM son una herramienta prometedora para el desarrollo de futuras terapias. Hasta la fecha, se ha producido una rápida expansión de los estudios tanto preclínicos como clínicos que utilizan el secretoma derivado de las CMM con las ventajas de un sistema libre de células. Aunque este secretoma parece ser una terapia prometedora para diversas enfermedades y lesiones, todavía resta saber más sobre la generación, la naturaleza y la modificación del mismo. En este trabajo, analizamos el potencial regenerativo del secretoma de células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton de cordón umbilical. Dado que SPARC está implicada en la remodelación y ensamblaje de la ME, así como en la regulación de los procesos de migración y proliferación celular, entre otros, hipotetizamos que la sobreexpresión de SPARC en las CMM tiene un efecto directo sobre la composición de su secretoma y potencialmente les conferiría una mayor capacidad regenerativa. Para abordar nuestra hipótesis, modificamos mediante un sistema lentiviral simple y reproducible a las CMM para que sobreexpresen la proteína de secreción SPARC (+SPARC). Además, generamos una línea de células en las cuales noqueamos parcialmente la expresión de SPARC (KD-SPARC) con el fin de analizar en mayor profundidad el rol de esta proteína en el proceso regenerativo. Por otro lado, en busca de desarrollar en un futuro una plataforma biotecnológica que sea fácilmente trasladable a la clínica, nos propusimos poner a punto un sistema de cultivo en suspensión que permita hacer más eficiente el proceso de cultivar, amplificar y aislar el secretoma de las CMM.<br/>Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos permiten concluir que el cultivo 3D de CMM puesto a punto es una plataforma eficiente que permite obtener grandes cantidades de células y aislar su secretoma, ahorrando tiempo y espacio de trabajo. Demostramos que modificamos la expresión de la proteína SPARC en las CMM con un protocolo simple y reproducible. Mediante ensayos in vitro utilizando queratinocitos y fibroblastos de piel humana tratados con el medio condicionado (MC) de CMM wild type (WT) y modificadas, demostramos que el secretoma de derivado de las CMM induce cambios sobre la migración y proliferación de las células tratadas. Más aún, estos cambios son SPARC-dependientes y tipo celular-específicos. Asimismo, el tratamiento con los MC de células WT, +SPARC y KD-SPARC en un modelo de cicatrización de heridas in vivo, nos permitió reforzar los resultados obtenidos anteriormente, observando una aceleración del proceso regenerativo con MC de células +SPARC y un evidente retraso en la cicatrización de los ratones tratados con el MC derivado de CMM KD-SPARC.<br/>En conjunto, estos hallazgos demuestran que SPARC cumple un clave en el proceso de cicatrización de heridas cutáneas, convirtiéndolo en un blanco terapéutico de interés que debe continuar siendo estudiado y caracterizado con el objetivo de desarrollar a futuro terapias regenerativas más eficientes.